在肥胖、胰岛素抵抗和其他代谢相关研究中，脂肪细胞是绕不开的研究对象，因为它直接参与脂质储存、脂解、葡萄糖摄取、胰岛素响应和产热等过程。在这个过程中，研究人员经常会发现某些基因在脂肪细胞分化前后出现了表达变化。但表达量升高或降低，只能说明这个基因与相应过程存在关联。要想搞清楚它究竟参与了哪些过程，还需要进一步进行功能验证。

一种常见的验证方法是转染siRNA到脂肪细胞中来降低目标基因的表达。siRNA进入胞质后，可以引导RNA诱导沉默复合体识别并降解互补的目标mRNA，减少相应蛋白的产生。研究人员再比较基因沉默前后的脂滴积累、脂解水平、胰岛素信号或线粒体呼吸等变化，就可以判断这个基因在脂肪细胞中发挥什么作用。并且siRNA造成的基因沉默通常是暂时的，这种方法也适合在特定分化阶段开展短期功能研究。

然而到了具体操作，脂肪细胞却没有普通细胞那么容易转染。与容易培养和处理的前脂肪细胞相比，成熟后的脂肪细胞内，积累了大量脂滴，胞质被压缩到细胞周边，细胞的体积、贴壁状态和机械耐受性也随之改变。尤其是从组织中分离的原代成熟脂肪细胞，密度较低、容易漂浮，也不容易像普通贴壁细胞一样培养和操作。这时直接沿用普通细胞的转染条件可能起不到好的敲低效果。同时，成熟脂肪细胞对消化、吹打和转染处理较为敏感，操作一不注意就可能影响脂滴状态和代谢功能。因此，脂肪细胞的转染既要提高siRNA的有效递送，也要尽量维持脂肪细胞原有的状态。

脂肪细胞siRNA转染及基因功能研究示意图

分化前后脂肪细胞的选择

这里需要强调的是，我们当然不能因为前脂肪细胞的好培养与好操作就一直不用成熟后的脂肪细胞，而是需要根据研究目的来选择。

如果想研究某个基因是否参与脂肪细胞分化，我们可以在前脂肪细胞阶段进行敲低，再诱导细胞分化，之后就可以通过观察脂滴积累以及PPARγ、C/EBPα、FABP4等指标的变化，判断目标基因是否影响了脂肪生成。

如果研究的是脂解、胰岛素响应、葡萄糖摄取或产热功能，我们就需要在细胞完成分化后再进行敲低。假如提前在前脂肪细胞中进行转染，目标基因表达降低可能先影响脂肪细胞的分化，使最终形成的细胞在成熟程度、脂滴积累或代谢状态上有差异。这样一来，后面观察到的脂解、胰岛素响应等变化，既可能是分化过程受到影响后留下的结果，也可能是目标基因直接调节成熟脂肪细胞功能的表现。这两种影响混在一起，实验结果就很难解释。

而且，siRNA的沉默效果还会随着时间逐渐减弱。Strnadová等在3T3-L1前脂肪细胞中敲低Fzd5后，持续监测了分化过程中的敲低效果，发现该效果逐渐下降，到了分化后期已经无法检测。为了研究Fzd5在成熟脂肪细胞中的作用，该方案另行在分化第8天转染siRNA，使Fzd5表达降低约70%。这说明，分化前获得的敲低效果未必能够维持到成熟阶段。所以在研究成熟脂肪细胞的功能时，我们需要把转染安排在更接近功能检测的时间。
 

脂肪细胞分化前后进行siRNA转染的研究路径
 

成熟脂肪细胞的转染方式

我们在将成熟脂肪细胞确定为研究对象后，接下来要解决的就是siRNA递送问题。

首先在脂肪细胞的siRNA递送时，可以采用正向转染以及反向转染两种方式之一。

正向转染通常是在细胞贴壁状态下，将已经形成的siRNA转染复合物加入培养基。这种方法操作简单，对细胞贴壁状态的干扰较小，适合前脂肪细胞，也可用于能够获得足够敲低效果的成熟脂肪细胞。但如果成熟脂肪细胞摄取复合物的能力较弱，就不能单靠增加siRNA或试剂用量的方式来增加siRNA转染量，这样可能会增加细胞负担，此时可以考虑改变细胞与复合物的接触方式。

反向转染是先将siRNA与试剂形成复合物，再加入经过消化和重悬的脂肪细胞，使细胞在重新贴壁的过程中与复合物充分接触，另一个好处是便于按照细胞数量控制siRNA与细胞之间的比例。Kilroy等采用这种方法，在成熟3T3-L1脂肪细胞和体外分化的原代人脂肪细胞中获得了足够的目标基因敲低效果。Isidor等也在两种方法的比较中发现，正向转染使成熟WT-1脂肪细胞中的Pkm mRNA降低约55%，反向转染后敲低幅度达到了93%。这些结果说明，当正向转染效果有限时，反向转染可以作为一种调整方法。
 

脂肪细胞正向转染与反向转染的操作过程

选择适合脂肪细胞的转染试剂

除了转染方式，还需要选择适合脂肪细胞的siRNA转染试剂。它有两个重要的功能，一是保护siRNA免受降解，二是能促进细胞摄取和胞内释放。

选好试剂后，可以先以产品说明书中的推荐条件作为起点，按照规定的用量、稀释方式、混合顺序和孵育时间配制siRNA转染复合物。这些条件都会影响复合物的形成，不能直接套用其他转染试剂的操作方法，也不宜凭经验随意增加试剂用量或延长孵育时间。

配制好的转染复合物怎样处理也要根据转染方式进行调整。采用正向转染时，需要注意细胞密度以及复合物加入是否均匀，使贴壁细胞能够充分接触复合物。采用反向转染时，则要根据细胞数量调整复合物用量，并控制消化程度、重悬后的细胞状态和重新铺板密度。

针对脂肪细胞脂滴丰富、常规转染效率较低并且对转染处理较为敏感等特点，达远辰光对LL TransR siRNA-a的递送体系进行了针对性优化。该试剂可与siRNA形成稳定的转染复合物，减少siRNA在递送过程中被降解，促进脂肪细胞摄取和胞内释放，从而提高目标基因的沉默效率。
 

参考文献：
[1] Strnadová M, Thor D, Kaczmarek I. Protocol for changing gene expression in 3T3-L1 (pre)adipocytes using siRNA-mediated knockdown. STAR Protocols. 2024;5(2):103075. DOI: 10.1016/j.xpro.2024.103075.

[2] Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9). DOI: 10.1371/journal.pone.0006940.

[3] Isidor MS, Winther S, Basse AL, et al. An siRNA-based method for efficient silencing of gene expression in mature brown adipocytes. Adipocyte. 2016;5(2):175–185. DOI: 10.1080/21623945.2015.1111972.