从降压药、抗过敏药，到近年来备受关注的GLP-1类药物，许多常见治疗手段背后都能看到G蛋白偶联受体（GPCR）的身影。这个拥有800余个成员的膜蛋白家族，长期以来都是药物研发中最重要的靶点类型之一。
尽管已有大量靶向GPCR的药物获批，但这类受体的药物开发仍面临不少实际问题。其中一个原因是GPCR并不是一个形态固定的受体，而是处于多种构象的动态平衡中。不同配体与受体形成的相互作用不同，会以不同方式改变这种平衡，使受体更倾向于某些构象状态。这些构象差异可能传递至受体胞内侧，进一步影响其与G蛋白或β-arrestin的结合，最终产生不同的下游信号和药理作用。
很长一段时间里，GPCR的这些短暂而动态的构象状态难以通过结构生物学方法捕捉。不过，随着冷冻电镜（Cryo-EM）技术的发展，研究人员开始能够解析由配体、GPCR以及G蛋白等转导蛋白组成的复合物，进而获得配体识别、受体激活和转导蛋白偶联等环节的结构信息。由此，GPCR结构研究也从以正构口袋和配体识别为主，逐渐扩展至变构位点发现、信号偏向解析和候选分子优化。

从正构位点看配体识别与选择性
正构口袋是GPCR药物发现中最先受到关注的区域，但许多同源受体具有相似的正构口袋。一个分子即使能够与受体稳定结合，也未必具有理想的亚型选择性。因此，结构研究不仅需要确定配体结合的位置，还需要分辨哪些相互作用是同类受体共有的，哪些结构差异可能影响配体选择性。
肽类配体与GPCR的结合，为理解这些问题提供了较为直观的结构基础。与多数小分子相比，肽配体通常具有更大的受体结合界面，其识别过程可能同时涉及胞外结构域、胞外环和跨膜核心。通过解析完整的信号复合物，Cryo-EM可以呈现这些区域与配体之间的相互作用，帮助研究人员分析肽配体的不同部分如何参与受体结合与激活。
以B1类GPCR中的GLP-1R为例，肽配体的C端主要与受体胞外结构域接触，N端则深入跨膜核心并触发受体激活。对retatrutide与GLP-1R、GIPR和GCGR复合物的结构研究进一步显示，该配体既保留了三种受体共有的关键相互作用，也能够适应不同受体的局部结构差异。
 

Retatrutide与GLP-1R、GIPR和GCGR的共同识别与局部结构适配示意图

然而，并非所有同源受体都能在正构位点找到足以用于选择性设计的结构差异。随着更多GPCR复合物结构得到解析，正构口袋之外的调控区域开始进入药物发现视野，其中最受关注的方向之一就是变构位点。

正构口袋之外：变构位点提供新的调控空间
在正构口袋之外，GPCR还存在一些能够调节受体功能的结合区域，即变构位点。结合这些位点的分子通常不与内源性配体竞争同一结合空间，而是通过改变受体的构象平衡，增强或削弱正构配体的作用。其中，正变构调节剂（PAM）能够增强正构配体的结合或信号，负变构调节剂（NAM）则会降低其作用。由于部分变构位点在受体亚型之间具有更明显的结构差异，所以它们为提高药物选择性提供了新的空间。
Cryo-EM解析的GPCR复合物结构显示，变构位点可能位于跨膜螺旋之间、受体与脂质膜的交界处，或靠近转导蛋白结合界面。例如，腺苷A1受体正变构调节剂MIPS521结合在由TM1、TM6和TM7围成的膜侧口袋中，能够稳定受体的活化构象，并增强受体与G蛋白之间的相互作用。GLP-1R正变构调节剂LSN3160440则同时接触受体和GLP-1肽，类似“分子胶”一样加强两者的结合。
这些结构也表明，变构效应可能随着正构配体的变化而改变。因此，评价变构分子时，需要同时考虑配体组合和信号检测终点。
变构位点也不只分布在受体膜侧。在部分GPCR中，变构口袋可以进一步延伸至胞内区域，并靠近受体与G蛋白的结合界面。由于距离受体—转导蛋白界面更近，结合胞内位点的分子还可能直接参与两者之间的相互作用。
PTH1R小分子激动剂PCO371就是一个代表性案例。PTH1R通常由甲状旁腺激素等肽类配体从胞外侧结合并激活，而PCO371结合在受体胞内侧的变构口袋中，与天然肽配体占据的正构位点在空间上相互分离。Cryo-EM结构显示，PCO371不仅与受体形成相互作用，还直接接触Gαs的C端，从而稳定PTH1R—G蛋白复合物。这一结果表明，传统上主要由肽类配体激活的B1类GPCR，也可以通过胞内变构口袋被小分子调控，为口服小分子激动剂的设计和优化提供结构基础。
从MIPS521占据的膜侧口袋，到LSN3160440形成的“分子胶”，再到PCO371结合的胞内变构位点，这些结构展示了GPCR正构口袋之外不同的调控方式。Cryo-EM不仅拓展了对GPCR可成药空间的认识，也帮助解释变构分子如何稳定受体构象、加强配体结合或影响受体与G蛋白的相互作用。
 

GPCR正构口袋之外的三种调控方式：膜侧变构结合、“分子胶”作用与胞内变构结合

在这些研究中，结构主要用于确定变构分子的结合位置和解释作用机制。而且近年来，GPCR结构信息开始进一步向药物发现前端延伸，被用于虚拟筛选、结合模式验证和先导化合物优化。

从作用机制解析到候选分子发现
2024年，一项针对钙敏感受体CaSR的研究分别对270万和12亿个分子进行了结构对接。与百万级分子库相比，十亿级分子库获得的命中率提高了2.7倍，获得的命中物最高表现出前者37倍的效力。经过进一步的结构分析和药物化学优化，研究人员获得了纳摩尔级正变构调节剂。
其中一个PAM在离体器官实验中的效力约为cinacalcet的100倍，并在小鼠实验中降低了甲状旁腺激素水平。后续Cryo-EM结构显示，新发现的PAM能够使CaSR形成更接近活化状态的构象，为其药理作用和后续优化提供了结构解释。
这一研究形成了从受体结构、虚拟筛选到实验验证和结构回溯的完整路径。Cryo-EM在其中不再只是用于解释已有分子的结合方式，也成为筛选新化学骨架和指导后续优化的一部分。不过，这些结果仍处于临床前研究阶段，其成药性和安全性还需要进一步验证。
 

CaSR结构驱动的候选分子发现路径：从超大规模虚拟筛选到药理优化与Cryo-EM结构验证

Cryo-EM为这些难解析靶点提供了另一条结构研究路径。它不需要蛋白结晶，可以研究较大分子量复合物、膜蛋白体系和多构象样品，通过三维分类、局部精修、focused classification 等数据处理方法，还可以帮助研究人员区分不同构象状态，从而观察小分子结合前后靶点结构的变化。

Cryo-EM结构仍需药理学验证
上述研究表明，Cryo-EM可以帮助确定配体的结合位置，并解释不同分子如何影响受体构象和转导蛋白偶联。不过，结构所呈现的是特定实验条件下的构象状态，不能单独代表受体在细胞中的全部动态变化，也不能直接说明一个分子具有更好的药理作用。
结构本身的解读也需要其他证据支持。特别是在受体与脂质膜的交界区域，局部密度可能来自目标配体，也可能来自脂质、胆固醇或样品制备过程中使用的其他成分。用于稳定GPCR复合物的工程化G蛋白、抗体片段或融合蛋白，也可能对受体构象产生一定影响。
因此，GPCR结构研究通常需要与定点突变、配体结合、信号通路和构效关系等实验相互验证。对于变构调节剂和具有信号选择性的分子，还需要同时考虑正构配体、G蛋白亚型、细胞背景和检测终点。总体而言，Cryo-EM更适合回答分子“在哪里结合”“为什么产生这种作用”以及“下一轮可以如何优化”，而最终的药理特征仍需要通过功能实验进行确认。
 

结构研究的价值，最终体现在研发决策中
这些研究提示，GPCR药物设计所面对的并不只是一个孤立的结合口袋，而是由配体、受体、膜环境和转导蛋白共同组成的调控系统。Cryo-EM使这一系统中的不同状态和作用界面能够被比较，也让许多原本只能通过药理现象推测的机制，转化为可以进一步验证的结构假设。
未来更重要的问题，不是获得更多结构本身，而是能否将结构差异与分子活性、构效关系和疾病相关功能联系起来。如果一项结构研究能够帮助团队判断是否继续某个化学骨架、优先验证哪个位点，或确定下一轮分子修饰方向，它才真正进入了药物发现流程。
因此，GPCR结构项目需要从具体研发问题出发，明确希望解释的配体识别、变构调节或转导蛋白偶联机制，再据此设计复合物构建和数据分析策略。达远辰光可围绕GPCR及其配体—G蛋白或β-arrestin复合物提供Cryo-EM研究支持，帮助研发团队将结构结果与后续药理验证和候选分子优化相衔接。

参考文献：
[1] Kim J, et al. Structural insights into GPCR signaling activated by peptide ligands: from molecular mechanism to therapeutic application. Experimental & Molecular Medicine. 2025;57:1467–1481. DOI: 10.1038/s12276-025-01497-y.
[2] Zhang L, et al. The impact of cryo-EM on determining allosteric modulator-bound structures of G protein-coupled receptors. Current Opinion in Structural Biology. 2023;79:102560. DOI: 10.1016/j.sbi.2023.102560.
[3] Liu F, et al. Large library docking identifies positive allosteric modulators of the calcium-sensing receptor. Science. 2024;385(6715):eado1868. DOI: 10.1126/science.ado1868.